Los biorreactores de bioprocesos abordan el problema del escalado sustituyendo las superficies de cultivo fijas por soportes de gran superficie suspendidos o dispuestos dentro de volúmenes compactos de reactor. Para las células animales dependientes del anclaje, los sistemas de microportadores son la solución principal: las células se adhieren a microesferas, mientras que la mezcla mantiene esas microesferas suspendidas en todo el medio de cultivo. Esto crea una alta relación superficie-volumen, favorece el crecimiento de alta densidad y permite que los biorreactores convencionales de tanque agitado produzcan vacunas, proteínas terapéuticas y bioquímicos a mayor escala.
La idea central: El escalado no se consigue simplemente haciendo más grande un matraz. Requiere conservar la superficie de adhesión que necesitan las células, al tiempo que se mejoran la mezcla, el suministro de nutrientes, la transferencia de oxígeno y la eliminación de residuos en un entorno de reactor controlable.
Por qué la dependencia del anclaje complica el escalado
Las células necesitan una superficie sólida de crecimiento
Las células dependientes del anclaje deben adherirse a un sustrato adecuado, como plástico tratado, vidrio, colágeno u otro material de matriz extracelular, antes de poder proliferar.
En el trabajo de laboratorio, este requisito se puede gestionar mediante matraces T, botellas de rodillos o recipientes multicapa. Sin embargo, a escala de producción, el área superficial necesaria resulta difícil de proporcionar de forma económica y operativa.
Los recipientes convencionales escalan horizontalmente
El cultivo tradicional de superficie se amplía añadiendo más recipientes en lugar de aumentar el volumen de un solo recipiente. Este enfoque consume una superficie considerable y aumenta la mano de obra, la manipulación, el riesgo de contaminación y la variabilidad del proceso.
La limitación es la relación superficie-volumen del recipiente. Un gran volumen de líquido no resulta útil si no contiene suficiente superficie accesible para la adhesión celular.
La inhibición por contacto limita la expansión de la superficie
Muchas células dependientes del anclaje dejan de proliferar cuando forman una capa densa sobre una superficie. Por tanto, aumentar el número de recipientes planos puede convertirse en una forma ineficiente de incrementar la producción celular total.
El proceso necesita una forma de proporcionar un área de adhesión considerablemente mayor sin multiplicar el número de recipientes de cultivo individuales.
Cómo los biorreactores de microportadores resuelven el problema del área superficial
Los microportadores convierten el crecimiento en superficie en un cultivo suspendido
Los microportadores son pequeñas microesferas sólidas o porosas que proporcionan sitios de adhesión para las células. Se suspenden en un medio líquido dentro de un tanque agitado modificado, un lecho fluidizado u otro reactor relacionado.
Esta disposición transforma un cultivo dependiente de la superficie en un cultivo de superficie distribuido por todo un volumen líquido. Por lo tanto, el reactor puede utilizar el volumen, la mezcla y la instrumentación de los equipos convencionales de bioprocesos, conservando al mismo tiempo el entorno de adhesión requerido por las células.
Una gran superficie cabe dentro de un volumen compacto
Los microportadores proporcionan una alta relación superficie-volumen porque numerosas microesferas pequeñas exponen sus superficies por todo el reactor. Los sistemas habituales utilizan materiales como dextrano reticulado con recubrimientos de colágeno unidos covalentemente o aplicados de otro modo.
Las concentraciones de microportadores indicadas en las referencias proporcionadas oscilan aproximadamente entre 3 y 25 g/L, dependiendo del soporte y del diseño del proceso. Aumentar la superficie disponible del portador puede incrementar el número de células cultivadas por volumen de reactor, siempre que los nutrientes, el oxígeno y la mezcla sigan siendo adecuados.
La mezcla del reactor mantiene disponible la superficie de crecimiento
La agitación distribuye los microportadores, las células, los nutrientes y el oxígeno por todo el cultivo. Se pueden seleccionar impulsores especializados o circulación por elevación de aire para proporcionar una suspensión adecuada, limitando al mismo tiempo el esfuerzo cortante hidrodinámico perjudicial.
El objetivo no es la agitación máxima, sino una circulación uniforme con una transferencia de masa suficiente y un daño mínimo a las células y las microesferas.
Cómo los biorreactores mejoran el control del proceso
El oxígeno y los nutrientes pueden controlarse
Los biorreactores permiten controlar activamente condiciones clave como el oxígeno disuelto, el pH, la temperatura, la agitación y la alimentación de nutrientes. Estos controles son más uniformes y medibles que las condiciones existentes en grandes conjuntos de botellas de rodillos o bandejas.
Dado que las células adheridas se distribuyen por los portadores, el proceso también debe garantizar que el fluido llegue a las superficies de los portadores y que el oxígeno y los nutrientes no se conviertan en factores limitantes dentro de los cultivos densos.
Los productos de desecho pueden eliminarse
Los cultivos de alta densidad consumen nutrientes rápidamente y pueden acumular subproductos tóxicos como amonio y lactato. Los sistemas capaces de realizar perfusión suministran continuamente medio fresco mientras eliminan el medio agotado.
Esto reduce la exposición prolongada a metabolitos inhibidores y puede favorecer fases de cultivo más largas o productivas que un proceso por lotes cerrado.
Los productos frágiles pueden recuperarse antes
Al final de los cultivos por lotes, la lisis celular puede liberar proteasas y sialidasas que degradan o modifican el producto objetivo. La operación continua o semicontinua puede reducir esta exposición al eliminar el medio que contiene el producto mientras las células permanecen viables.
Los sistemas de perfusión también pueden integrarse con la captura del producto en tiempo real, lo que permite aislar las proteínas frágiles poco después de su producción.
Configuraciones de reactor más allá de los microportadores
Reactores de fibra hueca
Los sistemas de fibra hueca o de capilares artificiales proporcionan una gran superficie de adhesión en las superficies externas de los capilares. Los nutrientes y los gases se desplazan a través de la estructura de las fibras, mientras las células permanecen adheridas a la superficie disponible.
Estos reactores pueden proporcionar altas relaciones superficie-volumen, pero su comportamiento de transporte interno y sus operaciones de recuperación difieren de los de los sistemas de microportadores agitados.
Lechos empacados y fluidizados
Los reactores de lecho empacado y de lecho fluidizado utilizan soportes de inmovilización para crear superficies densas de adhesión. Los lechos empacados mantienen el soporte prácticamente inmóvil, mientras que los lechos fluidizados hacen circular las partículas a través del medio.
Pueden proporcionar una superficie muy elevada, aunque la distribución del fluido, la caída de presión, la canalización y el escalado del comportamiento del flujo requieren una ingeniería cuidadosa.
Láminas enrolladas y placas apiladas
Los reactores de láminas enrolladas y los propagadores de placas apiladas aumentan el área superficial disponiendo numerosas superficies planas muy próximas entre sí. Los separadores y las funciones integradas de elevación de gas o aireación ayudan a mantener el flujo de nutrientes y gases entre las superficies.
Estos sistemas pueden ser útiles cuando las células o los procesos no se adaptan bien a los microportadores libremente suspendidos, pero conservan una mayor parte de la complejidad geométrica asociada al cultivo de superficie.
Las botellas de rodillos siguen siendo útiles para los trenes de inóculo
Las botellas de rodillos proporcionan una superficie giratoria y siguen siendo útiles para la expansión inicial o la preparación del inóculo. Su relación superficie-volumen comparativamente baja las hace menos adecuadas como plataforma principal de producción para procesos a gran escala con células adheridas.
La ruta moderna de escalado suele pasar de botellas de rodillos o bandejas a biorreactores de microportadores u otros biorreactores de gran superficie.
Qué debe conservarse durante el escalado
El esfuerzo cortante hidrodinámico debe mantenerse dentro de la tolerancia celular
Los reactores más grandes modifican el movimiento del fluido, el comportamiento del impulsor, la dispersión de gases y la turbulencia local. Las células animales dependientes del anclaje suelen ser sensibles a un esfuerzo cortante excesivo, y los microportadores pueden añadir efectos de colisión y abrasión.
Por tanto, el escalado requiere igualar condiciones de ingeniería relevantes, como la calidad de la suspensión, la potencia de entrada, el tiempo de mezcla y el rendimiento de la transferencia de gases, en lugar de copiar únicamente el volumen del recipiente.
La adhesión y la distribución celular deben mantenerse uniformes
Las células deben adherirse eficazmente al portador y permanecer distribuidas por la superficie disponible. Una adhesión deficiente, la agregación de portadores o una suspensión inadecuada pueden crear regiones con poco crecimiento y regiones con una densidad local excesiva.
La química del portador, el recubrimiento, la concentración, la estrategia de inoculación y la agitación forman parte del diseño del escalado.
El procesamiento celular puede cambiar con las condiciones de cultivo
Los cambios en el oxígeno disuelto, la glucosa, el suministro de nutrientes y las condiciones hidrodinámicas pueden afectar no solo al crecimiento celular, sino también al procesamiento de proteínas en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi.
Por lo tanto, para los productos recombinantes, el objetivo del escalado es tanto la cantidad de células como la calidad del producto, incluidas las modificaciones postraduccionales adecuadas, como la glicosilación.
Comprender las compensaciones
Los microportadores añaden complejidad al proceso
Los cultivos con microportadores requieren controlar la suspensión de las microesferas, la adhesión celular, la concentración de portadores, la agitación y, a menudo, la transferencia de microportador a microportador. La cosecha de células o la separación de las células de los portadores también puede ser más compleja que la cosecha de un cultivo convencional en suspensión.
Estos requisitos se justifican cuando la línea celular o el producto disponible exige adhesión, pero aumentan la complejidad del desarrollo y la operación.
La alta densidad puede crear nuevas limitaciones
Una alta relación superficie-volumen no garantiza automáticamente una elevada productividad. Los cultivos densos aún pueden experimentar limitaciones de oxígeno, nutrientes o acumulación de residuos si la transferencia de masa y la perfusión son insuficientes.
Por tanto, la capacidad del reactor debe evaluarse utilizando la densidad celular viable, la productividad específica, la calidad del producto y la duración del cultivo, en lugar de considerar únicamente el área del portador.
La calidad del producto puede disminuir con una expresión excesiva
Niveles de expresión muy elevados pueden sobrecargar la maquinaria de procesamiento intracelular. Esto puede provocar un procesamiento incompleto o cambios en las características del producto, incluida una sialilación reducida.
Puede ser necesario rediseñar el medio, suplementar precursores, utilizar inhibidores enzimáticos, realizar ingeniería de líneas celulares para reducir la apoptosis y aplicar una alimentación controlada junto con el escalado del reactor.
Los distintos tipos de reactor presentan riesgos diferentes
Los sistemas de microportadores agitados ofrecen principios de monitorización y escalado conocidos, pero exponen las células y los portadores a la agitación. Los sistemas de fibra hueca y de lecho empacado pueden proporcionar una gran superficie con menor agitación del volumen total, pero pueden dificultar la distribución del flujo, la monitorización y la recuperación del producto.
La mejor configuración depende de la línea celular, los requisitos de adhesión, la sensibilidad del producto, el método de cosecha y la escala de producción requerida.
Cómo aplicar esto a su proyecto
La estrategia de biorreactor adecuada depende de aquello que limite su cultivo actual: la superficie disponible, la sensibilidad celular, el suministro de nutrientes, la estabilidad del producto o la recuperación posterior.
- Si su prioridad es maximizar la densidad celular: Utilice una configuración de microportadores, lecho empacado, lecho fluidizado o fibra hueca que proporcione un área de adhesión considerablemente mayor por unidad de volumen del reactor.
- Si su prioridad es una manipulación celular suave: Seleccione una mezcla o circulación de bajo esfuerzo cortante y valide la calidad de la suspensión, las colisiones entre portadores y las condiciones de transferencia de oxígeno.
- Si su prioridad es la calidad del producto: Controle el oxígeno disuelto, la glucosa, los nutrientes y la duración del cultivo, mientras monitoriza las modificaciones postraduccionales y la productividad específica.
- Si su prioridad es la estabilidad del producto: Considere la perfusión con captura rápida del producto para limitar la exposición a metabolitos, proteasas y sialidasas liberados durante cultivos prolongados o en fases tardías.
- Si su prioridad es un escalado práctico: Utilice botellas de rodillos o bandejas para preparar el inóculo y, posteriormente, pase a un biorreactor de microportadores caracterizado para la expansión a escala de producción.
Al combinar soportes de adhesión de gran superficie con una gestión controlada del fluido y el intercambio de medio, los biorreactores de bioprocesos hacen que la producción a gran escala de células animales dependientes del anclaje sea técnica y operativamente viable.
Tabla resumen:
| Desafío del escalado | Solución del biorreactor | Beneficio principal |
|---|---|---|
| Área de adhesión limitada | Microportadores, fibras huecas, lechos empacados o placas apiladas | Gran superficie en volúmenes compactos |
| Limitaciones de nutrientes y oxígeno | Mezcla, aireación, oxígeno disuelto y alimentación controlados | Crecimiento celular más uniforme |
| Acumulación de residuos | Perfusión e intercambio de medio | Menor exposición al amonio y al lactato |
| Sensibilidad al esfuerzo cortante | Impulsores o sistemas de circulación de bajo esfuerzo cortante | Mejor viabilidad celular y suspensión de los portadores |
| Inestabilidad del producto | Eliminación continua y captura rápida del producto | Menor exposición a proteasas y sialidasas |
| Variabilidad del escalado | Monitorización del pH, la temperatura, la agitación y la productividad | Rendimiento del proceso más uniforme |
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